Figlio del famoso pittore fiorentino Domenico Ghirlandaio (1449-1494), Ridolfo portò avanti lo stile pittorico fiorentino. Domenico morì quando il figlio aveva solo undici anni, che studiò con uno zio, ma soprattutto con Fra Bartolomeo (1472-1517).
Le opere realizzate tra il 1504 e il 1508 mostrano la marcata influenza di Fra Bartolomeo e di Raffaello (1483-1520), di cui era amico. Nel 1508, Raffaello gli chiese di raggiungerlo a Roma, ma egli preferì restare a Firenze e divenne un artista di spicco in città, dove realizzò pale d'altare, affreschi e ritratti. Dipinse grandi tele sceniche in varie occasioni pubbliche, come il matrimonio di Giuliano de' Medici (1479-1516) e l'arrivo a Firenze del cugino di questi, Giovanni di Lorenzo de' Medici, come papa Leone X (1475-1521).
Nella prima parte della sua vita Ridolfo del Ghirlandaio fu un artista onesto e coscienzioso, ma dal 1527 circa, iniziò il suo declino, dopo che aveva già accumulato una notevole ricchezza, più che sufficiente per mantenere in opulenza la sua grande famiglia di quindici figli, e le sue opere divennero di maniera e ripetitive.
Tra i suoi capolavori vi sono molti dipinti a olio: La salita di Cristo al monte Calvario, ora a Palazzo Antinori; l'Annunciazione nell'abbazia di Montoliveto, vicino Firenze; l'Incoronazione della Vergine, del 1504; la Natività e una predella nell'Oratorio del Bigallo di Firenze, con cinque pannelli raffiguranti la Natività e altre storie. Nel 1514, sui soffitti della Cappella di san Bernando a Palazzo Vecchio, realizzò un affresco con la Trinità, con le teste dei dodici apostoli e i loro simboli, un'Annunciazione; dipinse anche un'Assunzione della Vergine che dona la sua cintola a san Tommaso, nel coro della cattedrale di Prato.
Nello stesso periodo realizzò delle opere che mostrano le sue migliori abilità, una ricca espressività, vigorosità e il sicuro metodo pittorico raggiunto: San Zanobi risuscita un bambino, Traslazione del corpo di san Zanobi, Vergine e santi, nella chiesa di San Pietro Maggiore a Pistoia. Nel 1521 eseguì l'opera a grandezza naturale della Pietà, per Sant'Agostino, Colle Val d'Elsa. Intorno al 1526 completò l'Assunzione, nella quale si trova anche un autoritratto. Dipinse anche un eccellente ritratto del Granduca Cosimo I de' Medici da giovane, e un Ritratto di giovane, esposto agli Uffizi. Nel 1543 realizzò una serie di affreschi nel monastero di Santa Maria degli Angeli. Alla National Gallery di Londra si trova la sua Salita di Cristo al monte Calvario. Un gran numero di pale d'altare furono eseguite dal Ghirlandaio con l'assistenza del suo alunno preferito, Michele Tosini (1503-1577), che dal suo maestro prese il soprannome di Michele di Ridolfo.
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